摘要：提出了一種多重巢式固相PCR的方法,以微流控芯片為載體,采用紫外交聯(lián)方式將寡核苷酸序列固定在芯片上,構(gòu)建了陣列式固相PCR-陣列(PCR-Array)芯片,用于細(xì)菌和病毒類高致病性病原微生物的并行檢測。選擇新疆出血熱病毒、埃博拉病毒、炭疽桿菌和布魯氏菌4種代表性高致病性病原微生物為研究對象,通過基因工程手段構(gòu)建了包含有炭疽桿菌和布魯氏菌特異性基因片段的重組質(zhì)粒載體,利用病毒包裝技術(shù)構(gòu)建了包含有兩種病毒特異性基因片段的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒,完成了4種高致病性病原微生物陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備,并以此作為實(shí)驗(yàn)樣本,探究了多重巢式固相PCR-Array芯片的制備方法和擴(kuò)增體系。結(jié)果表明,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,多重巢式固相PCR-Array芯片檢測4種高致病性病原微生物的檢出限達(dá)10 copy/μL以下量級。本方法靈敏度高,特異性好,同時,引物空間上的隔離避免了相互干擾,提高了檢測通量,在多種病原微生物快速并行檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。