敲除PaLoc毒力島的無(wú)毒性艱難梭菌菌株的構(gòu)建

饒鳳琴; 程玉梅; 吳昌學(xué); 王義; 崔古貞; 齊曉嵐; 洪偉貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 貴州貴陽(yáng)550004; 貴州醫(yī)科大學(xué)附院綜合ICU; 貴州貴陽(yáng)550004; 美國(guó)奧本大學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)系; 美國(guó)奧本阿拉巴馬36849; 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院; 貴州貴陽(yáng)550025

艱難梭菌
paloc毒力島
基因敲除
活菌疫苗
毒性基因

摘要：目的:使用CRISPR-Cfp1系統(tǒng)敲除艱難梭菌毒性(PaLoc)毒力基因島,構(gòu)建無(wú)毒性艱難梭菌菌株。方法:使用分子克隆方法,構(gòu)建針對(duì)PaLoc毒力島的基因打靶質(zhì)粒pWH53;將pWH53質(zhì)粒轉(zhuǎn)化艱難梭菌630菌株后,誘導(dǎo)Cpf1蛋白表達(dá),PCR篩選發(fā)生雙交換的PaLoc敲除突變株,測(cè)序驗(yàn)證設(shè)計(jì)位點(diǎn)是否發(fā)生等位雙交換。結(jié)果:PCR結(jié)果顯示,獲得的16株轉(zhuǎn)化子中有8株為敲除PaLoc突變株,陽(yáng)性率為50%;測(cè)序結(jié)果顯示,獲得的8株敲除PaLoc突變株均在設(shè)計(jì)位點(diǎn)發(fā)生了等位雙交換。結(jié)論:成功構(gòu)建艱難梭菌毒性毒力島敲除PaLoc突變株。

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